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Sep 10, 2023

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Parásitos y vectores

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 186 (2023) Citar este artículo

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El virus del río Ross (RRV) es el arbovirus transmitido por mosquitos más común y extendido de Australia y es un importante problema de salud pública. Con el aumento de los impactos antropogénicos en la vida silvestre y las poblaciones de mosquitos, es importante que entendamos cómo circula el RRV en sus puntos críticos endémicos para determinar hacia dónde deben dirigirse los esfuerzos de salud pública. Los métodos de vigilancia actuales son eficaces para localizar el virus, pero no proporcionan datos sobre la circulación del virus y sus cepas en el medio ambiente. Este estudio examinó la capacidad de identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) dentro de la región variable E2/E3 mediante la generación de haplotipos completos a partir de una variedad de muestras derivadas de trampas para mosquitos.

Se desarrolló un nuevo flujo de trabajo de amplificación de cebadores en mosaico para amplificar RRV con análisis utilizando MinION de Oxford Nanopore Technology y un protocolo bioinformático ARTIC/InterARTIC personalizado. Al crear una variedad de amplicones en todo el genoma, se permitió el análisis de SNP a escala fina al enfocarse específicamente en la región variable que se amplificó como un solo fragmento y establecer haplotipos que informaron la variación espacio-temporal de RRV en el sitio de estudio en Victoria.

Se diseñó e implementó con éxito una tubería bioinformática y de laboratorio en homogeneizados de trampas completas para mosquitos. Los datos resultantes mostraron que la genotipificación se podía realizar en tiempo real y que el consenso de trampa completo de los virus (con los principales SNP) se podía determinar de manera oportuna. Se detectaron con éxito variantes menores de la región variable E2/E3 de RRV, lo que permitió la determinación de haplotipos en muestras complejas de homogeneizados de mosquitos.

Los novedosos métodos bioinformáticos y de laboratorio húmedo desarrollados aquí permitirán una rápida detección y caracterización de los aislamientos de RRV. Los conceptos presentados en este cuerpo de trabajo son transferibles a otros virus que existen como cuasiespecies en muestras. La capacidad de detectar SNP menores y, por lo tanto, cepas de haplotipos, es de vital importancia para comprender la epidemiología de los virus en su entorno natural.

El virus del río Ross (RRV) (género Alphavirus, familia Togaviridae) es un arbovirus transmitido por mosquitos que es endémico de Australia y también se detecta en Papúa Nueva Guinea y las islas del Pacífico Sur [1]. RRV puede causar poliartritis en humanos, una forma debilitante de artritis que tiene el potencial de causar problemas de salud duraderos [1]. RRV también se presenta con síntomas como fiebre, sarpullido y fatiga en humanos [1]. También se han informado signos clínicos en caballos [2] y se los ha implicado como amplificadores del virus [3]. Los mosquitos vectores clave del virus en Australia son Aedes camptorhynchus, Ae. vigilax, Culex annulirostris [4] y Ae. notoscriptus [5]. Los macrópodos se han atribuido como el principal reservorio, pero otros mamíferos placentarios y aves también podrían actuar como reservorios [6]. La transferencia del virus se transmite a través de la picadura de un mosquito hembra y, ocasionalmente, un mosquito hembra infectado puede transmitir el virus verticalmente a sus huevos, lo que se conoce como transmisión transovárica [7,8,9]. La expansión de la población humana a los hábitats de los mosquitos está aumentando las interacciones entre humanos y mosquitos [10,11,12] y aumenta el riesgo de que los humanos se vean afectados por arbovirus (incluido el RRV) [13]. Se prevé que esta tendencia mundial aumente [14, 15] y, por lo tanto, es imperativo monitorear los virus transmitidos por mosquitos para apoyar la salud pública.

RRV se detectó por primera vez en 1958, cerca de Townsville, en el extremo norte de Queensland, Australia, y el aislamiento más antiguo (T48) se clasificó como G1 [16]. Hay cuatro genotipos principales de RRV, siendo G3 y G4 descendientes directos de G1, y G2 es su propio grupo separado [17, 18]. Cada uno de estos genotipos ocupa actualmente o ha ocupado históricamente regiones específicas de Australia. G1 y G2, aunque aparentemente ya no circulan, se encontraron comúnmente en Queensland y Australia Occidental en los años anteriores al 2000 [19]. G3, otro genotipo histórico, se localizó predominantemente en las Islas Cook a fines de la década de 1970 y principios de la de 1980 [19]. Algunas secuencias G3 se observaron en varios estados australianos a principios de la década de 2000, y la detección más reciente fue un aislado de Tasmania en 2014. Estos tres genotipos han sido reemplazados en su mayoría por el genotipo más común que circula actualmente, G4. La cepa G4 de RRV se divide en sublinajes, determinados por análisis de similitud de nucleótidos [19]. Los sublinajes G4, denominados G4A, G4B, G4C y G4D, se informaron en Australia Occidental, Victoria, Queensland, Nueva Gales del Sur, Papua Nueva Guinea y el Territorio del Norte, con los aislamientos más recientes (2018) asignados a G4B y G4A. sublinajes [19].

Los virus de ARN, como el RRV, mutan rápidamente debido a la ausencia del mecanismo de corrección de la exonucleasa 3' de su ARN polimerasa dependiente de ARN [20,21,22]. La actividad de exonucleasa de la enzima polimerasa juega un papel importante en la replicación del ácido nucleico, por lo que al reconocer una base incorporada incorrectamente, la dirección de la polimerasa se invierte y se elimina la base incorrecta. Los virus de ARN carecen de esta actividad y, por lo tanto, cualquier base incorporada incorrectamente permanecerá en la secuencia de ácido nucleico, lo que dará como resultado una mayor tasa de mutaciones en los virus de ARN en comparación con otros organismos, aunque algunas mutaciones darán como resultado mutaciones perjudiciales [23, 24]. Las regiones altamente variables, incluidas las secuencias de nucleótidos que codifican las glicoproteínas de la envoltura e interactúan con los receptores de la célula huésped, a menudo se usan para la caracterización de variantes virales, incluido el RRV [19, 25, 26]. En RRV, una región comúnmente utilizada para informar los estudios epidemiológicos moleculares son las regiones E2/E3 que codifican las glicoproteínas receptoras de superficie [19, 27, 28]. A menudo se observan niveles más altos de mutación en las glicoproteínas virales, con cambios de aminoácidos en estas regiones vinculados a aumentos en las tasas de transmisión entre los arbovirus, como en el chikungunya y el virus del Nilo Occidental [29].

La secuenciación del genoma completo (WGS) brinda la capacidad de evaluar la variación dentro de la muestra de un genoma objetivo dentro de muestras ambientales complejas, como trampas para mosquitos completas. El flujo de trabajo RAMPART de la red ARTIC [30] es una canalización basada en WGS que se ha utilizado en estudios de epidemiología molecular del brote del virus del Ébola de 2014-2016 en África occidental [31] y, posteriormente, se ha utilizado para la pandemia del virus del Zika en Sudamérica [30], poliovirus [32] y SARS-CoV-2 [33]. La red ARTIC utiliza un enfoque específico que utiliza la amplificación por PCR en mosaico y RAMPART para el mapeo de referencia en tiempo real para identificar el virus presente en la muestra [30, 34]. RAMPART es un sistema de análisis de extremo a extremo que incorpora programas de uso común (minimap2 [35] y Porechop [36]) en una GUI fácil de usar, lo que permite al usuario monitorear las ejecuciones de secuenciación de Oxford Nanopore MinION en tiempo real. Las lecturas anotadas de RAMPART se pueden procesar posteriormente. Actualmente, el análisis posterior para RAMPART se puede ejecutar utilizando InterARTIC GUI [37]. Esta tubería combina BCFtools [38], medaka [39], nanopolish [40] y minimap2 [35] entre otros programas para generar SNP llamados genomas virales a partir de datos de Nanopore.

En este estudio, personalizamos los flujos de trabajo de InterARTIC y RAMPART para RRV y los aplicamos a mosquitos recolectados en el campo de trampas de vigilancia de arbovirus que se homogeneizaron para la detección de virus. Además, identificamos SNP dentro de una región variable significativa de RRV y asignamos haplotipos virales para informar la ecología viral en la región de Gippsland Lakes de Victoria.

Los homogeneizados de molienda completa de mosquitos RRV positivos y los aislados derivados de cultivos de células RRV utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1; Se proporciona un desglose de especiación de mosquitos para las trampas cuando estén disponibles (ver archivo adicional 1). Se prepararon moliendas de trampas enteras de mosquitos a partir de colecciones de mosquitos durante la noche de los sitios de muestreo en la Fig. 1, utilizando métodos descritos previamente [41] y aislamientos derivados de cultivos celulares [42].

Mapa de los sitios de muestreo de mosquitos agrícolas de Victoria en Gippsland, Victoria. El mapa ilustra los sitios de muestreo de 2019 a 2022 que se utilizaron en este estudio. Mapas derivados del sitio web de Google Maps

Para confirmar la presencia de RRV y evaluar la cantidad relativa de ácido nucleico genómico de RRV en una muestra de trampa de homogeneizado de mosquitos (usando el valor CT), se aplicó un ensayo específico de RRV RT-qPCR a las muestras de ARN extraídas. Este ensayo se dirige al gen E2 y produce un amplicón de 67 pb. Se realizó RT-qPCR en las muestras de ARN extraídas como se informó [42,43,44].

Los cebadores se diseñaron para el esquema de amplicón de mosaico utilizando el portal en línea PrimalScheme [30]. Se seleccionaron once secuencias del genoma completo y se cargaron como referencia a PrimalScheme (Tabla 2); hubo representantes de los cuatro genotipos diferentes de RRV, con genotipos que incluyen G4A y G4B, que se detectaron recientemente en Victoria, así como los genotipos históricos (G2 y G1).

La secuencia ARBO012 (G4B, MW489504) se estableció como referencia para PrimalScheme para representar una secuencia RRV contemporánea de Wellington Shire, Victoria, Australia. La longitud del amplicón se fijó en 1500 pb sin seleccionar las opciones "High GC" ni "Finned". Luego, IDT (Integrated DNA Technologies, IA, EE. UU.) sintetizó la salida de la secuencia del cebador de PrimalScheme como oligonucleótidos con un total de nueve pares de cebadores, cada uno de los cuales producía amplicones superpuestos de 1500 pb de longitud (Tabla 3). La región variable E2/E3 de RRV se capturó dentro de un único amplicón (par de cebadores 7) para el posterior análisis de diversidad viral intratrampa y SNP. Los cebadores se resuspendieron a una concentración de 100 µM con dos grupos de cebadores, "par" e "impar", preparados para la aplicación de mosaico, siguiendo los métodos de la red ARTIC [45]. En cada una de las dos agrupaciones de cebadores, la concentración de cebador individual fue de 0,015 µM por cebador, con una concentración total final agrupada de 100 µM. Luego se diluyó para hacer una solución de trabajo de 10 µM y se usó en las siguientes reacciones de amplificación por PCR.

El ARN viral se extrajo de homogeneizados de molienda de trampa completa de mosquitos (Tabla 1) y de material RRV derivado de cultivo celular utilizado como control positivo [42]. Se procesaron cincuenta microlitros de cultivo de células infectadas con RRV y homogeneizados de molienda de trampa completa de mosquitos utilizando un kit de preparación de aislamiento de ARN viral MagMax™ estándar en el procesador MagMax™ (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) 24 Express. Por cada 50 µl de homogeneizado de molienda trampa o cultivo de células virales, se mezclaron 65 µl de tampón de lisis con 1 µl de transportador de ARN, 65 µl de isopropanol al 100 %, 10 µl de perlas de ARN y 10 µl de potenciador de ARN, incluidos en el kit MagMax™. Se usaron dos rondas de cada uno de los lavados uno y dos (150 µl cada una). La extracción final se eluyó en 50 µl de tampón de elución.

La síntesis de ADNc se realizó en el ARN extraído usando 2 µl de 5X LunaScript RT SuperMix (New England Biolabs, MA, EE. UU.), que contiene hexámeros aleatorios, y esto se combinó con 8 µl del ARN extraído y se incubó a 25 °C durante 2 min, 55 °C durante 10 min seguido de una incubación final a 95 °C durante 1 min. El cDNA se mantuvo a 4 °C hasta que se usó para el enriquecimiento dirigido de RRV utilizando el esquema de amplificación del genoma completo en mosaico.

El ADNc derivado de los homogeneizados de molienda de trampa completa de mosquitos se amplificó por PCR según el método de amplificación Midnight 1200 kb [46] con modificaciones importantes. Para cada muestra, se prepararon dos reacciones ("impares" y "pares", Tabla 3). Cada reacción contenía 2,5 µl de ADNc molde, 9,6 µl de agua libre de nucleasas, 0,40 µl de una de las agrupaciones de cebadores de 100 µM y 12,5 µl de la mezcla maestra Q5 Hot Start Hi-Fi 2X (New England BioLabs, MA, EE. UU.) y se PCR amplificada bajo las siguientes condiciones: 98 °C por 30 s y 40 ciclos de 98 °C por 15 s con 65 °C por 7 min para enriquecer para RRV.

Los amplicones se secuenciaron utilizando una combinación del método GunIt [45] y el método LoCost [47] con modificaciones. Las 24 reacciones de PCR individuales (dos reacciones de PCR en mosaico por muestra de homogeneizado de mosquito) se combinaron y diluyeron en 12 grupos de 50 µl que contenían 2,5 µl de cada reacción de PCR en mosaico por muestra y 45 µl de agua libre de nucleasas. Para cada una de las 12 reacciones de PCR combinadas, 7,5 µl del producto de PCR diluido correspondiente, 5 µl de agua libre de nucleasas, 1,75 µl de Ultra End II Prep Reaction Buffer (New England BioLabs, MA, EE. UU.) y 0,75 µl de Ultra End II Prep Enzyme Mix (New England BioLabs) se combinaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min, 65 °C durante 15 min y se incubaron en hielo durante 1 min.

Para generar muestras con código de barras para la secuenciación, se combinaron 4,2 µl de la plantilla en mosaico de PCR con 3 µl de agua, 2,5 µl del código de barras NB (SQK-LSK109 y EXP-NBD104, Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido), 10 µl de Blunt/TA Ligase Master Mezclar (New England BioLabs) y 3 µl de agua. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 min, 65 °C durante 10 min y en hielo durante 1 min.

Se combinaron veinte microlitros de las reacciones con código de barras para formar la biblioteca final para la secuenciación y se combinaron con perlas ProNex (Promega, WI, EE. UU.) a 0,7 veces la cantidad del volumen combinado (168 µl de perlas). La mezcla se incubó durante 5 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se eliminó cuando estaba claro. Las perlas se lavaron dos veces resuspendiendo en 250 µl de tampón de fragmentos cortos (Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido), se mezclaron y sedimentaron y se descartó el sobrenadante. A continuación, las perlas se lavaron en 200 µl de etanol al 70 % (temperatura ambiente), teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Se eliminó el etanol y se secó el sedimento durante aproximadamente 1 min o hasta que brilló. El sedimento se resuspendió en 31 µl de tampón de elución (Oxford Nanopore Technologies), se incubó durante 2 min y se transfirió a un tubo Eppendorf limpio, formando la biblioteca de ácidos nucleicos para la secuenciación. Se cuantificó una alícuota de 1 µl de la biblioteca en Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) utilizando un kit de alta sensibilidad dsDNA.

Para la ligadura de los adaptadores de secuenciación a las muestras con código de barras, el total de la biblioteca MinION reparada en el extremo (30 µl) se combinó con 10 µl de NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×), 5 µl de Adapter Mix (AMII) y 5 µl Quick T4 DNA Ligase y se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Se agregaron perlas ProNex, en una proporción de 0,7 veces el volumen de la biblioteca, a la mezcla anterior (35 µl de perlas) y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente y se eliminó el sobrenadante cuando quedó transparente. Las perlas sedimentadas se lavaron con 250 µl de tampón de fragmentos cortos (Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido); se eliminó el sobrenadante y se volvió a lavar. El sedimento se resuspendió en 13 µl de tampón de elución (Oxford Nanopore Technologies), se incubó durante 2 min a temperatura ambiente y el eluato se recogió para la secuenciación. Se cuantificó un microlitro de la biblioteca ligada al adaptador de secuencia final en un Qubit usando el kit dsDNA.

Luego, la muestra eluida se cargó en una celda de flujo MinION preparada previamente, siguiendo los procedimientos estándar de carga y secuenciación de MinION (ADN genómico por ligación, versión GDE_9063_v109_revAJ_14 de agosto de 2019).

Tanto RAMPART [34] como InterARTIC [37] se modificaron para su uso con RRV siguiendo las instrucciones de las respectivas páginas de GitHub. Se generaron archivos de cebador para este estudio (conjunto de amplicón de 1500 pb), así como la secuencia de referencia RRV que se anotó y cargó en el archivo primer.json para que RAMPART la utilice. También se cargó una serie de genomas RRV que cubren todos los genotipos, incluidos los virus existentes (G1 y G2), en el archivo references.fasta para que RAMPART realice los pasos de mapeo de referencia.

RAMPART se utilizó para monitorear la progresión de la secuenciación de MinION, inicialmente para identificar muestras genotípicas mixtas y para genotipificar las muestras mediante el mapeo de referencias en el archivo references.fasta.

Para comparar los datos de muestras completas de trampas para mosquitos, era necesario normalizar todas las secuencias de consenso generadas. Para reducir cualquier sesgo potencial hacia los genotipos en la etapa de mapeo de referencia, se creó una secuencia RRV de consenso genérica. El consenso se generó utilizando 123 genomas completos y parciales descargados de NCBI (ver archivo adicional 2). Todas las secuencias se cargaron en Geneious (V11.0.11) y se alinearon usando el algoritmo MUSCLE. Luego, las secuencias se recortaron al genoma más corto desde los extremos 5 'y 3'. El consenso de las secuencias genómicas recortadas (11 296 nt de longitud) se exportó y utilizó como referencia para todos los análisis siguientes (en lo sucesivo, "secuencia de referencia RRV"). La región E2/E3 del genoma RRV utilizada para el análisis a escala fina correspondía a los nucleótidos 8222–9743 de esta secuencia de referencia.

La canalización de nanopulido InterARTIC se ejecutó en muestras de homogeneizado de trampa completa de mosquitos (después de 24 h de secuenciación MinION) utilizando los parámetros definidos por la opción "Virus personalizado". El archivo BAM resultante se usó para el procesamiento posterior. Solo se utilizaron muestras de trampas de homogeneizado de mosquitos que generaron los nueve amplicones para el análisis de la secuencia del genoma completo. Se usaron muestras de trampas de homogeneizado de mosquitos que generaron el séptimo amplicón que corresponde a la región E2/E3 del genoma RRV para análisis de SNP menores y análisis de haplotipos.

El archivo BAM se ejecutó con el siguiente comando BCFtools [38] (V 1.14-GCC-11.2.0) para la generación del genoma completo [bcftools mpilup -a INFO/AD -O u -d 10,000 -L 9000 -f reference.fasta sorted /bam/de/nanopolish.sorted.bam| llamada bcftools -mv -O u | norma bcftools -O u -f referencia.fasta | filtro bcftools -O u -i'%QUAL > 180' | vista bcftools -O v -i "(INFO/AD[1]/INFO/DP) > 0.45" > código de barras.vcf | bcftools consenso barcode.vcf > barcode_consensus.fasta]. La secuencia de consenso del genoma completo resultante de cada muestra de trampa de homogeneizado de mosquito individual se usó en el análisis filogenético.

Se realizó un análisis filogenético de máxima verosimilitud (ML) utilizando (i) secuencias de consenso del genoma completo recopiladas de NCBI, (ii) secuencias generadas a partir de las 16 trampas para mosquitos de trampa completa positivas para RRV, (iii) dos controles positivos (ARBO012-MinION01 y ARBO012-MinION02, Tabla 2) y (iv) secuencias incluidas en un estudio RRV anterior [19]. El árbol ML fue generado por MEGA11 [48], después de la alineación con MAFFT [49], usando el módulo General Time Reversable en MEGA11 y un valor de arranque de 1000.

El análisis de secuencia de la región E2/E3 del genoma RRV se realizó con SAMtools [38] (1.15-GCC-11.2.0) e iVar [50] con el siguiente comando [samtools mpilup -aa -A -d 1,000,000 -B -Q 0 -f referencia.fasta bam/file/from/nanopolish/.sorted.bam -r NCBI:8222-9743 | variantes de ivar -p nombre_muestra -q 20 -t 0.03 -r referencia.fasta -m 30]. Se examinaron los archivos .tsv posteriores y se eliminaron los indels, ya que se consideraron poco fiables para el análisis a escala fina. Los SNP restantes se usaron para análisis a escala fina y se compararon entre trampas para examinar la consistencia y la variación potencial. Los SNP se transfirieron a un archivo .csv donde luego se usaron para la identificación manual de haplotipos en las trampas que examinaban las frecuencias y las posiciones de los nucleótidos. Los SNP se llamaron usando un umbral más bajo que el análisis del genoma completo (3% de lecturas frente a la configuración estándar para BCFtools).

La haplotipificación de las muestras trampa se realizó a través de la inspección visual de la alineación, prestando especial atención a las frecuencias menores de SNP identificadas a través del archivo .csv. Los haplotipos específicos para cada trampa se determinaron por la presencia o ausencia de ciertos SNP en la región E2/E3 del genoma RRV hasta que todos los SNPS de todos los aislamientos se atribuyeron a haplotipos. Las lecturas se inspeccionaron manualmente para garantizar que los SNP de haplotipo asignados de manera adecuada estuvieran presentes utilizando IGV (Versión 2.5.0 [51, 52, 53]) y Tablet (Versión 1.21.02.08 [54]). El análisis filogenético de los haplotipos se realizó en MEGA11 como se describe anteriormente en el análisis WGS.

Los análisis de RAMPART e InterARTIC indicaron que el RRV, presente en los 20 homogeneizados de trampas de campo para mosquitos, recolectados en Wellington Shire, Victoria, pertenecía a un solo genotipo, G4A. Dieciséis de los homogeneizados de trampas de campo para mosquitos produjeron una cobertura suficiente en los nueve amplicones (indicada por la presencia de los nueve amplicones en una cobertura > 20x) para permitir el ensamblaje de secuencias genómicas completas de RRV y el posterior análisis filogenético.

El análisis filogenético de máxima probabilidad de las 16 secuencias de consenso del genoma completo confirmó la agrupación de las muestras dentro de G4A (Fig. 2). No hubo agrupación espacio-temporal de las 16 secuencias de consenso genómico analizadas de Wellington Shire entre 2020 y 2022 (Fig. 2).

Árbol filogenético de máxima verosimilitud (ML). Árbol filogenético de genomas RRV completos utilizando un modelo GTR, bootstrap 1000. El árbol utiliza secuencias de nucleótidos de consenso del genoma de 16 trampas para mosquitos recolectadas en seis ubicaciones. En el análisis se incluye el control de secuenciación positivo para RRV (un aislado derivado de un cultivo celular, ARBO012) que se incluyó en ambas ejecuciones de secuenciación de MinION. Las secuencias se distinguen en sus genotipos por color.

No hubo secuencias idénticas de trampas de genoma completo de RRV entre las trampas de homogeneizado de mosquitos. Las secuencias de genoma completo de RRV más diversas se encontraban entre la trampa HS-22-Jan y MP-20-Mar-5, que diferían en 34 nucleótidos en todo el genoma (0,3 % de divergencia en 11 296 nt). Las secuencias del genoma completo de RRV más similares fueron de las trampas MP-20-Mar-2 y WP-20-Mar-1, que diferían en solo un nucleótido en todo el genoma (Fig. 2).

De las 20 trampas secuenciadas en este estudio, 18 produjeron un amplicón E2/E3 de longitud completa que se usó para la detección de SNP a una frecuencia de > 3 % de todas las lecturas para respaldar el análisis de haplotipos a escala fina.

Los datos de la secuencia de control positivo (ARBO012) generados a partir de dos ciclos de secuenciación fueron idénticos a la secuencia de referencia generada previamente (basada en Illumina) en el amplicón E2/E3, lo que indica que no hubo variación entre ciclos entre el análisis de SNP en la región variable .

Se detectaron veinte SNP en el amplicón E2/E3 de 1500 pb de 18 trampas. Siete de los 20 SNP dieron como resultado cambios de aminoácidos, y uno de los siete SNP generó un codón de terminación (Fig. 3). De los 20 SNP, se determinaron diez haplotipos únicos (Fig. 3). Filogenéticamente, los diez haplotipos diferentes estaban representados en tres clados diferentes (etiquetados del 1 al 3). Los haplotipos RRV carecían de cualquier estructura espacio-temporal, con el haplotipo más prominente, 2.2, detectado en nueve trampas separadas, a lo largo de los tres años muestreados y en las seis ubicaciones (Fig. 4B, Tabla 4). Este haplotipo se detectó en GB tres veces durante un período de 10 meses (entre abril de 2020 y enero de 2021; Tabla 4). El segundo haplotipo más común fue el 3.1, detectado en siete trampas a lo largo de 1 año en las localidades MP, WP y LS (Fig. 4B, Tabla 4). Este haplotipo se detectó en MP dos veces durante 13 días en marzo de 2020 en dos eventos de captura diferentes. Solo se observaron ocho haplotipos en un evento de captura una vez (1.1 y 1.2 en HS, 3.2, 3.4 y 2.1 en MP, 3.3 en WP y 2.3 y 2.4 en GB; Fig. 4B, Tabla 4).

Diversidad de trampas intramosquitos RRV E2/E3 y análisis genético de diferentes haplotipos observados en Wellington Shire. Ilustración esquemática de Amplicon 7 (región E2/E3 8222–9743nt) con todas las mutaciones de haplotipo indicadas a partir de la secuencia RRV consenso genérica. Los haplotipos (1.1 a 3.4) se enumeran a la izquierda. Se usó MEGAX para visualizar la alineación y traducir las bases de nucleótidos en residuos de aminoácidos.

Diversidad temporal de trampas intramosquitos de RRV E2/E3. Un árbol filogenético de máxima verosimilitud (ML), modelo GTR, bootstrap 1000 de los haplotipos RRV generados con MEGAX. Los haplotipos se distinguen en sus genotipos por color. Todos son haplotipos del mismo genotipo, G4A. B Ilustración gráfica de la variación del haplotipo RRV E2/E3 espacio-temporal. Cada trampa está representada por un gráfico circular con la proporción y el número de haplotipos ilustrados con los colores correspondientes. Mapas derivados del sitio web de Google Maps

Se detectaron haplotipos mixtos en cinco de las 18 trampas. En cada una de las cinco trampas de haplotipos mixtos, el porcentaje de frecuencia de haplotipos menores varió de 0,7 a 18%. Dentro de cuatro trampas mixtas solo se observaron dos haplotipos, y una trampa de GB en 2022 mostró una mezcla de tres haplotipos. El SNP que resultó en el codón de parada estaba presente en el haplotipo 1.2 y solo se encontró una vez dentro de una trampa que tenía dos haplotipos y se detectó con una frecuencia del 17,6 % de las lecturas E2/E3 en esa trampa.

La secuenciación del genoma completo y la epidemiología genómica se utilizan cada vez más para comprender la diversidad viral durante una epidemia o un brote. Con la capacidad de detectar variantes menores y rastrear estas variantes a lo largo del tiempo y entre ubicaciones, los datos genómicos han demostrado ser útiles para monitorear epidemias. El análisis de las secuencias del genoma viral puede ayudar a comprender la ecología y la transmisión de los virus [55]. Además, el análisis de las secuencias del genoma puede identificar cambios potenciales de aminoácidos o nucleótidos que pueden afectar la virulencia y, posteriormente, la idoneidad de los ensayos de diagnóstico y las vacunas [56]. En este estudio, hemos desarrollado una nueva tubería bioinformática para RRV, un importante arbovirus transmitido por mosquitos en Australia. Esta tubería se usó luego para analizar una colección de homogeneizados de trampas de mosquitos completos RRV positivos para comprender la estructura genética espacio-temporal del virus dentro de Wellington Shire, Gippsland, Victoria, Australia. La plataforma de secuenciación MinION de Oxford Nanopore Technologies fue seleccionada para este estudio debido a su capacidad para generar lecturas de secuencias más largas a partir de genomas virales que permiten el análisis a escala fina y la resolución de haplotipos virales dentro de muestras ambientales complejas [50]. Esto contrasta con las plataformas de secuenciación de lectura corta como Illumina, ya que la diversidad de secuencias se limita a la longitud de lectura, lo que dificulta la capacidad de evaluar con confianza genomas individuales individuales y haplotipos virales [57].

G4 es el genotipo contemporáneo más común de RRV en Australia [17, 19, 58]. Tanto G4A como G4B se han detectado en Victoria, Queensland y Australia Occidental [19, 59]. De las cinco secuencias del genoma completo de Victoria analizadas previamente, se detectó un agrupamiento espacial, con G4B detectado solo en el área de Gippsland Lakes y G4A detectado en el interior de Victoria [59]. En este estudio que utilizó RAMPART, la amplificación de mosaicos de amplicones y la tubería de procesamiento viral establecida del grupo ARTIC [34], el análisis de las secuencias genómicas de 20 trampas para mosquitos completas adicionales reveló que G4A se encuentra en Gippsland Lakes. Esta es una observación interesante ya que, hasta este estudio, solo se había visto G4B en Gippsland, en contraste con Australia Occidental, donde tanto G4A como G4B se han detectado en las regiones norte, sur y central durante muchos años [19]. La apariencia aparente de G4A en Gippsland en este estudio puede reflejar un muestreo insuficiente anterior y la generación de WGS para análisis posteriores.

La falta de estructura viral espacio-temporal de RRV en el área de Gippsland Lakes y la detección de diez haplotipos virales distintos son consistentes con poblaciones virales heterogéneas en esta área. La detección de una población viral heterogénea y la falta de estructura espacio-temporal en la región de los lagos Gippsland no son sorprendentes dado que muchos huéspedes vertebrados y especies de vectores diferentes pueden estar involucrados en la transmisión del RRV [6, 7, 60] y que están presentes en el condado local de Wellington [61]. Además, los extensos humedales de las marismas saladas facilitan los criaderos productivos de los mosquitos de las marismas saladas Ae. camptorhynchus y Ae. vigilax, con rangos de vuelo informados de 3 [62]—6 km [63] y hasta 9 km [64] (excluyendo la dispersión asistida por el viento).

La transmisión transovárica de arbovirus (transferencia viral a través de huevos de mosquito) a menudo se puede observar en mosquitos machos capturados en el campo que no habrían ingerido una comida de sangre; por lo tanto, el único método para que estos mosquitos alcancen el arbovirus es directamente de la madre [9]. Esto se ha detectado previamente para otros arbovirus [9] (incluido el virus de la encefalitis japonesa [65] y el virus de la encefalitis equina del este [66]) y se ha visto específicamente en Ae. vigilax para RRV [67]. La detección repetida del haplotipo 2.2 en GB durante un lapso de 9 meses (abril de 2020 a enero de 2021) sugiere que RRV pasó el invierno en los huevos de los mosquitos [68], ya que está por debajo de la tasa de subestación de nucleótidos informada para RRV [19].

El SNP 9327 que produjo un cambio de aminoácido en el haplotipo 1.2 que dio como resultado un codón de parada se detectó a una baja frecuencia del 17,6 % en una muestra de trituración completa. La aparición del codón de terminación (SNP 9327) en una muestra de haplotipo mixto fue inesperada. Sin embargo, se han descrito previamente informes de proteínas truncadas y codones de parada en proteínas estructurales [69, 70]. Específicamente, una mutación de cambio de marco en el gen S1 de la proteína de punta SARS-CoV-2 resultó en una proteína S1 truncada en un bajo porcentaje. Como había un gran porcentaje de proteínas S completamente formadas, se planteó la hipótesis de que la proteína S1 funcional y disponible se adquiriría de los virus en funcionamiento en el enjambre de cuasiespecies virales [69]. Se ha detectado un codón de parada similar en la proteína nsP3 del virus O'nyong'nyong, un alfavirus similar al RRV, y se ha formulado la hipótesis de que la presencia del codón de parada ha alterado la infectividad del virus en el vector huésped Anopheles gamdiae. [70].

Al utilizar RAMPART e InterARTIC, solo se identificará el genotipo y la secuencia del genoma completo. Para facilitar el análisis de haplotipos virales, se tuvieron que usar SNP menores a escala fina que representan cuasiespecies por encima de un umbral del 3 % de lecturas que tienen un nucleótido alternativo a la referencia. En este estudio, desarrollamos una nueva canalización bioinformática utilizando iVar [50] y una evaluación visual de SNP vinculados individuales sobre la región E2/E3 para medir la variación dentro del huésped.

Los programas de análisis de SNP como BCFtools call [38], LoFreq [71], FreeBayers [72], WhatsHap [73, 74], VirStrain, HaploFlow, HaploClique, Shorah, nanopolish [75], etc., no se consideraron adecuados para la análisis, ya que aplican un nivel de umbral que es demasiado alto para detectar alelos menores y, en cambio, informan un consenso de la trampa en lugar de las secuencias representativas del genoma dentro del enjambre viral.

Los cebadores de genoma completo desarrollados en este ensayo cubrieron solo el CDS de RRV. La exclusión de las UTR 3′ y 5′ puede dar lugar a mutaciones perdidas en el virus, y esta es una limitación del estudio.

Con la capacidad de detectar alelos menores de poblaciones de mosquitos, se puede comprender una imagen más completa de las cepas de RRV circulantes. Una mayor vigilancia podría mostrar la propagación de ciertos haplotipos virales y podría aplicarse para comprender el tamaño de la población dentro de una temporada determinada. Los métodos desarrollados aquí también podrían aplicarse a otros arbovirus transmitidos por mosquitos de importancia para la salud pública.

Los conjuntos de datos generados a partir de este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

Aedes

Ácido desoxirribonucleico complementario

Secuencia de codificación

Umbral de ciclo

Culex

Ácido desoxirribonucleico de doble cadena

Sobre proteico 2/3

Playa Dorada, Wellington, Victoria

Interfaz gráfica del usuario

Desembarco de Holanda, Wellington, Victoria

Madreselvas, Wellington, Victoria

Loch Deporte, Wellington, Victoria

Punto Marley, Wellington, Victoria

Reacción en cadena de la polimerasa

Asignación de lectura, mapeo y análisis filogenético en tiempo real

Ácido ribonucleico

Virus del río Ross

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa

Polimorfismo de nucleótido simple

región sin traducir

Secuenciación del genoma completo

Pila de leña, Wellington, Victoria

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Agricultura Victoria, AgriBio, Centro de AgriBiociencia, Bundoora, VIC, 3083, Australia

Ellen M. de Vries, Noel OI Cogan, Brendan C. Rodoni y Stacey E. Lynch

Escuela de Biología de Sistemas Aplicados, Universidad La Trobe, Bundoora, VIC, 3083, Australia

Ellen M. de Vries, Noel O. I. Cogan & Brendan C. Rodoni

División de Sensores y Efectores, Grupo de Ciencia y Tecnología de Defensa, Fishermans Bend, VIC, 3207, Australia

Aneta J. Gubala

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EDV realizó todo el trabajo de análisis, técnico y preparó el primer borrador del manuscrito. NOIC, AG, BCR y SEL contribuyeron al desarrollo de las ideas presentadas aquí, asistieron en la redacción y edición del manuscrito y supervisaron el proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ellen M. de Vries.

No aplica.

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

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Especiación de mosquitos a partir de trampas de muestra. Datos tabulados de todas las especies de mosquitos y números detectados en las trampas utilizadas para la secuenciación de RRV. Solo se muestran las trampas que tenían datos aplicables.

Genomas RRV utilizados para la generación de un genoma completo para la estandarización; Se utilizaron 123 secuencias del genoma completo de RRV para generar un archivo de consenso singular para estandarizar todas las secuencias del genoma completo de RRV generadas. Todas las secuencias se enumeran con su número de acceso y se descargaron de NCBI.

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de Vries, EM, Cogan, NOI, Gubala, AJ et al. Seguimiento genómico a escala fina del virus del río Ross mediante secuenciación de nanoporos. Vectores de parásitos 16, 186 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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Recibido: 29 noviembre 2022

Aceptado: 11 de marzo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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